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查看详情兽药急性毒性试验(LD50测定)指导原则
一、概述
(一)定义与目的
急性毒性试验是指一日内对动物单次或多次给药,连续观察给药后动物产生的毒性反应及死亡情况的试验方法。经口(注射)一次性或24h内多次给予受试物后,在短时间内观察实验动物所产生的毒性反应,引起半数致死的剂量称为半数致死剂量,通常用LD50表示。这是评价兽药急性毒性的常用方法。
为了确保急性毒性试验(LD50测定)结果的真实性、可靠性和可追溯性,根据新兽药研究的规律,结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。
(二)适用范围
本指导原则适用于兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂的急性毒性作用测定。
二、试验设计
(一)材料与方法
1.实验动物
采用两种性别的初成年小鼠和/或大鼠进行试验。小鼠体重为18~22g,大鼠体重为180~220g。动物购买后环境适应饲养3~5天。
2.受试药物及配制
(1)申报兽药的原料或制剂 应为与其他试验同一批号的产品。
(2)受试物溶液配制 一般采用水或食用植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)配制受试物溶液。可考虑用吐温-80作为助溶剂,或用羧甲基纤维素钠、明胶、淀粉等配制成混悬液,不能作成混悬液时,可制备成其它型式(如糊状物等)。必要时可选用二甲基亚砜溶解受试物,但不能采用具有明显毒性的有机溶剂。如采用未知毒性的溶剂应设对照组观察。
3.受试药物给药方法
按受试药物检测要求经口或注射给药。一般一次性给予受试药物。如估计受试物的毒性很低或溶解度很低,可一日内多次给予,每次间隔2~3h,仍合并为一次剂量计算。若总剂量达到5000mg/kg仍不引起动物死亡时,即停止更多次的给予。
给予受试物体积要求小鼠为0.1~0.2mL/10g体重,大鼠为0.5~1.0 mL/100 g体重。经口给予受试物,动物应隔夜空腹进行(一般禁食8~12h左右,不限制饮水)。
(二)试验步骤
1.预试验
每组设4只实验动物(雌、雄各半),拟定高剂量组剂量,再按3~5的倍数递减设定若干剂量组,依次进行试验,找出4/4致死剂量和0/4致死剂量。
如果高剂量组已达5000mg/kg的剂量,实验动物死亡率为0/4,并且将动物数增至10只(雌、雄各半),并重复两次试验动物均未出现死亡,则可结束整个急性毒性试验,急性毒性试验(LD50测定)结论为:受试物LD50大于5000mg/kg。
2.正式试验
一般设5~7个剂量组。根据预备试验获得的4/4致死剂量(b)和0/4致死剂量(a)的比值来确定正式试验组数(N);比值为2~3时,设4~5组;比值为3~10时,设5~7组;比值大于10时,设7组。
按下列公式求得相邻两组剂量比值(r):
r = log-1
以预试验获得的4/4致死剂量(b)作为正式试验高剂量组(第一组)的剂量,按r值等比求得其它各剂量组的剂量。
(1)实验动物称重、标记编号和分组
雄、雌动物分开进行正式试验,每组不小于10只动物。分别对雄、雌动物进行编号标记及称重,按设计试验组数(N)对实验动物进行分组。分组采用完全随机法。
(2)受试药物溶液配制
按“1:K系列稀释法”等容量配制各剂量组所需的受试药物溶液,根据设计的试验剂量,按试验动物给予受试药物的体积要求,首先确定最大剂量组(如第一组)所需配制的受试药物溶液浓度C1以及各剂量组所需受试药物溶液的体积v。
受试药物母液应配制的浓度C=C1,应配制的体积V(mL)按下列公式计算:
V=(其中K=)
根据母液浓度及体积计算需称取的受试药物量(mg或mL)。
称取受试药物,置烧杯内,加入选定的溶剂溶解或稀释,转入容量瓶内,充分混匀并定容,即获得浓度C=C1的受试物母液。从中取出供最大剂量组(如第一组)给药用的溶液体积v,向原溶液中加入同体积的溶剂,混匀后溶液浓度为C1×K,正好是第二组所要求的剂量浓度C2;从中取出供第二组给药用的溶液体积v,再加入同体积的溶剂,混匀后溶液浓度为C2×K,正好是第三组所要求的剂量浓度C3。依此类推,配制得到各剂量组所需浓度及体积的受试药物溶液。
(3)给药方法
按实验动物经口(注射)给予受试药物的体积要求,根据各实验动物的体重,计算各实验动物给予的受试药物体积。
按要求保定实验动物进行灌胃或注射给药。如在给药过程中因挤压、呛肺等造成死亡,需及时补足每组的动物数量。
(4)试验观察
实验动物给药后一般观察7天,若给药4天后继续有死亡的,则需观察14天,必要时可延长观察至28天。认真观察实验动物中毒的发生、发展过程(观察项目见6.1),获取中毒特点及毒作用特征,对死亡动物需进行解剖,观察其中毒病理变化,并作好记录。
(三)数据整理
当雄性和雌性实验动物对受试药物反应差异显著时,应分别对其试验数据进行整理,计算各自的半数致死量(LD50);性别差异不显著,则将雄性和雌性实验动物的试验数据集中整理,统一计算分析。
根据试验记录,整理获得下表中的各项数据。
组别 | 动物数(n) | 给药剂量 (mg/kg或mL/kg) | 剂量对数 (x) | 死亡动物数 (r) | 死亡率 (p) | 存活率 (q) | p·q |
…… |
半数致死量(LD50)计算方法:
将试验获得的各项数值代入下列公式
LD50=lg-1
Sx50=
LD50的95%可信限= lg-1(lgLD50±1.96×Sx50)
式中:
Xm —— 最大剂量的对数值;
i —— 组距,即相邻两组剂量对数值之差;
p —— 各剂量组死亡率(以小数表示);
q —— 各剂量组存活率,q =1-p;
—— 各剂量组死亡率之和;
n —— 各组动物数;
Sx50 —— lgLD50的标准误差
(四)结果评定
根据实验动物给药后中毒症状出现的时间、症状表现、死亡出现时间、尸体解剖病理变化及半数致死量(LD50),参照表3-2化学物急性毒性(LD50)剂量分级表,对受试药物进行评定。评定内容包括:
受试物主要中毒症状表现;
受试物半数致死量(LD50)及其95%可信限(单位mg/kg);
受试物毒性分级;
(五)注意事项
1.本指导原则仅对寇氏(korbor)法的技术环节及要求进行了规定,采用其它方法进行急性毒性试验需参照国家标准GB 15193.3-2003的相关内容进行。
2.除特别注明外,试验用水为蒸馏水,试剂为分析纯试剂,动物为SPF级实验动物。
3.实验动物饲养环境要求达到SPF级。
三、试验报告
为公正、科学地评价药物的毒性,对试验报告内容做如下要求:
1.试验目的。
2.试验时间与地点。
3.试验设计者、负责人、参加者及电子邮箱。
4.受试药物需注明兽药名称、生产厂家、规格、生产批号及用法与用量。
5.试验动物的品种与品系、体重、日龄或月龄、健康状况、检疫情况等。
6.归纳总结该药物的试验结果,确定受试药物的LD50和并对其急性毒性进行评定等。
7.参考文献。
8.试验数据,应有详细的试验原始记录。原始资料保存处、联系人、电话。
9.试验单位(加盖公章)。
四、附录及说明
附表4-1 啮齿动物中毒表现观察项目
器官系统 | 观察及检查项目 | 中毒后一般表现 |
中枢神经系统及 躯体运动 | 行为 | 改变姿势,叫声异常,不安,呆滞 |
动作 | 震颤,运动失调,麻痹,惊厥,强直性动作 | |
各种刺激的反映 | 易兴奋,知觉过敏或缺乏知觉 | |
大脑及脊髓反射 | 减弱或消失 | |
肌肉张力 | 强直或弛缓 | |
自主神经系统 | 瞳孔大小 | 缩小或放大 |
分泌 | 流涎,流泪 | |
呼吸系统 | 鼻孔 | 流鼻涕 |
呼吸性质和速率 | 徐缓,困难,潮式呼吸 | |
心血管系统 | 心区触诊 | 心动过缓,心律不齐,心跳过强或过弱 |
胃肠系统 | 腹形 | 气胀或收缩,腹泻或便秘 |
粪便硬度和颜色 | 粪便不成形,黑色或灰色 | |
生殖泌尿系统 | 阴户,乳腺 | 膨胀 |
阴茎 | 脱垂 | |
会阴部 | 污秽 | |
皮肤和被毛 | 颜色,张力 | 发红,皱褶,松弛,皮疹 |
完整性 | 竖毛 | |
粘膜 | 粘膜 | 流粘液,充血,出血性紫绀,苍白 |
口腔 | 溃疡 | |
眼 | 眼睑 | 上睑下垂 |
眼球 | 眼球突出或震颤 | |
透明度 | 混浊 | |
其他 | 直肠或皮肤温度 | 降低或升高 |
一般情况 | 姿势不正常,消瘦 |
附表4-2 化学物急性毒性(LD50)剂量分级表
级别 | 大鼠口服LD50/(mg/kg) | 相当于人的致死量(g/人) |
极毒 | <1 | 0.05 |
剧毒 | 1~50 | 0.5 |
中等毒 | 51~500 | 5 |
低毒 | 501~5000 | 50 |
实际无毒 | 5001~15000 | 500 |
无毒 | >15000 | 2500 |
来源:兽药评审中心
原文链接:兽药急性毒性试验(LD50测定)指导原则.docx